检测报告

下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法.&sp;分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。&sp;按测定方法分为六个部分：(1)&sp;叶绿素a&sp;,&sp;b&sp;和c&sp;的分光光度法测定(三色法)&sp;;&sp;(2)&sp;叶绿素a&sp;的荧光检测法;&sp;(3)&sp;存在脱镁叶绿素a&sp;时叶绿素a&sp;的分光光度法测定;&sp;(4)&sp;存在脱镁叶绿素a&sp;时叶绿素a&sp;的荧光法测定;&sp;(5)&sp;高效液相色谱(HPLC)&sp;测定藻类的叶绿素及它们的降解产物;&sp;(6)&sp;HPLC&sp;测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。

藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素.&sp;浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a&sp;,b&sp;和c.叶绿素a&sp;在一切浮游藻类里大约占有机物干重的1～2&sp;%&sp;,是估计藻类生物量的好指标.&sp;细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响.脱镁叶绿素a&sp;(一种叶绿素a&sp;的普通降解产物)&sp;能够干扰叶绿素a&sp;的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a&sp;,它能在叶绿素a&sp;的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素a&sp;值的误差.&sp;当测定叶绿素a&sp;的时候还要测定脱镁叶绿素a.&sp;叶绿素a&sp;和脱镁叶绿素a&sp;之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标.下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法：

(1)&sp;叶绿素a&sp;,&sp;b&sp;和c&sp;的分光光度法测定(三色法)&sp;;

(2)&sp;叶绿素a&sp;的荧光检测法;&sp;

(3)&sp;存在脱镁叶绿素a时,叶绿素a&sp;的分光光度法测定;&sp;

(4)&sp;存在脱镁叶绿素a&sp;时叶绿素a&sp;的荧光法测定;&sp;

(5)&sp;高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物;&sp;(6)&sp;HPLC&sp;测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.

1&sp;叶绿素a&sp;,&sp;b&sp;和c&sp;的分光光度法测定(三色法)

用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度.&sp;叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大.&sp;为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞.

111&sp;　仪器和试剂

(1)&sp;分光光度计:用窄带的(015～210nm)&sp;.

(2)&sp;1cm&sp;,4cm&sp;和10cm&sp;光程的比色池.

(3)&sp;医用离心机.

(4)&sp;组织研磨器(好使用圆底的研磨管和捣杆)&sp;.

(5)&sp;离心管:15ml&sp;,有刻度和螺帽.

(6)&sp;过滤设备:过滤器,滤膜(0145μm&sp;孔径,47mm&sp;直径)&sp;或玻璃纤维过滤器(GFPC&sp;或GFPA&sp;,415cm&sp;直径)&sp;,真空泵.

(7)MgCO3&sp;悬浮液:在100ml&sp;蒸馏水中加入110g&sp;细粉末MgCO3&sp;.

(8)&sp;90&sp;%(体积比)&sp;丙酮水溶液.

112&sp;　测定程序

(1)&sp;离心或过滤浓缩水样.&sp;在离心前或过滤的后一步加入012ml&sp;MgCO3&sp;悬浮液.

(2)&sp;把样品置入组织研磨器,用2～3ml&sp;90&sp;%丙酮水溶液覆盖浸泡.

(3)&sp;把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90&sp;%丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液

中,用90&sp;%丙酮水溶液调节体积到5～10ml&sp;.

(4)&sp;在盖紧的离心管中于500g&sp;离心20min&sp;澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml&sp;有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.

(5)&sp;把萃取液移入1cm&sp;的比色池,在750、663、645&sp;和630nm&sp;测定吸光度(OD)&sp;.

113&sp;　计算

叶绿素a&sp;,b&sp;和c&sp;的测定分别使用663、645&sp;和630nm&sp;的吸光度.&sp;750&sp;nm&sp;的读数用来校正浑浊度.&sp;将每个色素的OD&sp;值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:

(1)&sp;叶绿素a&sp;(mgPl)&sp;=&sp;11164&sp;(OD663&sp;)&sp;–&sp;2116&sp;(OD645&sp;)&sp;+&sp;0110&sp;(OD630&sp;)

叶绿素b&sp;(mgPl)&sp;=&sp;20197&sp;(OD645&sp;)&sp;–&sp;3194&sp;(OD663&sp;)&sp;–&sp;3166&sp;(OD630&sp;)

叶绿素c&sp;(mgPl&sp;)&sp;=&sp;54122&sp;(OD630&sp;)&sp;–&sp;14118&sp;(OD645&sp;)&sp;–&sp;5153&sp;(OD663&sp;)

(2)&sp;各单位体积色素量的计算如下:

叶绿素a&sp;(mgPm3&sp;)&sp;=&sp;叶绿素a&sp;(mgPl&sp;)&sp;×萃取液的总体积(l)&sp;/&sp;水样体积(m3&sp;)

2&sp;叶绿素a&sp;的荧光检测法

叶绿素a&sp;的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少.&sp;而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,在430nm&sp;的激发波长和在663nm&sp;的发射波长抽取在试管内测定叶绿素a&sp;可过的佳灵感度.

211&sp;　仪器和试剂

(1)&sp;荧光计,备有高强度F4&sp;T.&sp;5&sp;蓝光灯,光电倍增管R&sp;–&sp;136&sp;(红敏)&sp;,可滑动窗孔,光发射(CS&sp;–&sp;2&sp;–&sp;64)

和光激发(CS&sp;–&sp;5&sp;–&sp;60)&sp;滤光片,以及一个高灵敏度门.

(2)&sp;其他设备和试剂同111

212&sp;　测定程序

(1)&sp;　用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:

用分光光度法测定浓度约为2、6、20&sp;和60μgPl&sp;的叶绿素a&sp;萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs

Fs&sp;=&sp;CaPRs

式中　Fs&sp;———灵敏度位置S&sp;的标定系数

Rs&sp;———灵敏度位置S&sp;的荧光计读数

Ca&sp;———分光光度法测定的叶绿素a&sp;浓度(μgPl)

(2)&sp;　在能够取得适中读数的各灵敏度位置测定样品的荧光,将读数乘以适当的标定系数,得到叶绿素a&sp;浓度..

3&sp;　存在脱镁叶绿素a&sp;时叶绿素a&sp;的分光光度法测定

由于脱镁叶绿素在接近叶绿素a&sp;相同的波长上有吸收,因而含有脱镁叶绿素时叶绿素a&sp;的测定值可能偏高.&sp;叶绿素a&sp;由于酸化作用变成脱镁叶绿素a&sp;,吸收峰的值比原来大约降低40&sp;%&sp;,并从663nm&sp;移至665nm&sp;,酸化前后产生的吸收峰之比为1170&sp;,可用来表观叶绿素a&sp;的浓度作脱镁叶绿素a&sp;的校正.

311&sp;　仪器和试剂

(1)&sp;同111

(2)&sp;HCl&sp;1mol·L&sp;–&sp;1

312&sp;　测定程序

(1)&sp;用90&sp;%丙酮水溶液萃取色素,离心澄清,在750、663nm&sp;读取OD&sp;值.

(2)&sp;在1cm&sp;的比色池中用两滴1mol·L&sp;–&sp;1&sp;HCl&sp;酸化萃取液,轻轻搅拌1～2min&sp;后在750、665nm&sp;读取OD&sp;值.

(3)&sp;酸化前OD663和酸化后OD665值都减去OD750值.

313&sp;　计算

使用校正过的值计算叶绿素a&sp;浓度(C)&sp;与脱镁叶绿素a&sp;浓度(P)

C(mgPm3&sp;)&sp;=&sp;26173&sp;(663b&sp;–&sp;665a)V1PV2L

P(mgPm3&sp;)&sp;=&sp;26173[117&sp;(665a)&sp;–&sp;663b&sp;]V1PV2L

式中V1&sp;———萃取液的体积(l)

V2&sp;———水样的体积(m3&sp;)

L&sp;———比色皿液层厚度(cm)

663b&sp;,665a&sp;分别为酸化前后90&sp;%丙酮水溶液萃取的吸光度.

26173&sp;是吸光度校正

4&sp;存在脱镁叶绿素a&sp;时叶绿素a&sp;的荧光法测定

用荧光法测定脱镁叶绿素a&sp;的浓度,需要测定酸化前后丙酮萃取液的荧光.&sp;叶绿素a&sp;由于酸化后变成脱镁叶绿素a&sp;,致使荧光降低,利用这一原理进行测定萃取液的脱镁叶绿素a&sp;浓度.

411&sp;　仪器和试剂

(1)&sp;同21a

(2)&sp;HCl&sp;1mol·L&sp;–&sp;1

(3)&sp;纯叶绿素a

412&sp;　测定程序

校准荧光计,在每一灵敏度位置测定酸化前后萃取液的荧光.&sp;计算校准系数(Fs&sp;)&sp;,用酸化前的荧光读数除以酸化后的荧光读数,算出酸化前后的荧光比.

413&sp;　计算

叶绿素a&sp;(mgPm3&sp;)&sp;=&sp;Fs&sp;(Rb&sp;–&sp;Ra)&sp;rP(r&sp;–&sp;1)

脱镁叶绿素a&sp;(mgPm3&sp;)&sp;=&sp;Fs&sp;(rRa&sp;–&sp;Rb)&sp;rP(r&sp;–&sp;1)

式中　Fs&sp;———灵敏度位置S&sp;的换算系数

Rb&sp;———萃取液酸化前的荧光

Ra&sp;———萃取液酸化后的荧光

r&sp;———RbPRa
&sp;

5&sp;　高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物

511&sp;　仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1)&sp;高效液相色谱仪,流速为210mlPm.

(2)&sp;装有100&sp;微升进样环管的高压进样阀.

(3)&sp;保护柱(410&sp;3&sp;015cm&sp;,&sp;C18&sp;,&sp;3μm)

(4)&sp;反相HPLC&sp;柱(C18&sp;,&sp;10cm&sp;,&sp;3μm)

(5)&sp;荧光检测器,波长为430&sp;±30nm&sp;,可发射超过600nm&sp;荧光.

(6)&sp;数据纪录装置,长条纸记录器或电子积分仪.

(7)&sp;注射器,玻璃,250μL

(8)&sp;HPLC&sp;洗脱剂:洗脱剂A(80∶15∶5&sp;;甲醇∶Ⅰ型试剂∶离子对溶液)&sp;,洗脱剂B(80∶20&sp;;甲醇∶丙酮)&sp;.

(9)&sp;校准标准物:分别将1ml&sp;纯叶绿素a&sp;和b&sp;溶于100ml&sp;90&sp;%丙酮中,用分光光度法测定其准确浓度.&sp;用上述叶绿素a&sp;和b&sp;标准物经盐酸酸化后制得脱镁叶绿素a&sp;+&sp;a′和b&sp;+&sp;b′标准物;从硅藻中萃取叶绿素c&sp;和脱植基叶绿素a&sp;,酸化脱植基叶绿素a&sp;制得脱镁叶绿素酸a&sp;,分别用薄层色谱法(TLC)&sp;纯化,分光光度法校准,作为标准物.

512&sp;　测定程序

(1)&sp;用洗脱剂A&sp;,流速为210mlPm&sp;,建立和平衡HPLC&sp;系统;校准荧光计的感光度,用叶绿素a&sp;标样的浓度大值作为满刻度.

(2)&sp;通过先前制备的标准物校准HPLC&sp;系统的工作标准.&sp;分别混合叶绿素与脱植基叶绿素a&sp;,脱镁叶绿素a&sp;和脱镁叶绿素酸a&sp;,作为混合标准物.&sp;混合1ml&sp;标准液与300μL&sp;离子对溶液,平衡5&sp;分钟后进样.&sp;混合1ml&sp;90&sp;%丙酮与300μL&sp;离子对溶液作为空白液.&sp;用150μL&sp;标准液漂洗注射器2&sp;次,注射器中吸入250μL&sp;标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满100μL&sp;的进样环管.&sp;建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高)&sp;的标准曲线.

(3)&sp;混合1ml&sp;90&sp;%丙酮色素提取物与300μL&sp;离子对溶液,作为进样样品.

(4)&sp;使用两步溶剂程序,用于优化叶绿素及其降解产物的分离.&sp;进样后,5&sp;分钟内将洗脱剂A&sp;转变为洗脱剂B&sp;,维持B15&sp;分钟,流速为210mlPm.&sp;在下一次进样前,需用洗脱剂A&sp;重新平衡色谱柱5&sp;分钟.&sp;总分析时间约为25&sp;分钟.

(5)&sp;用下列公式计算各色素的浓度

Ci&sp;=&sp;AsFiVe

PVEVs

式中　Ci&sp;=&sp;各色素的浓度mgPl

As&sp;=&sp;各次进样的色素峰面积

Fi&sp;=&sp;标准响应因子

Ve&sp;=&sp;进样体积(011ml)

VE&sp;=&sp;萃取体积(ml)

Vs&sp;=&sp;样品体积(l)

(6)&sp;这种方法仅用于叶绿素及其降解产物的定量.

(7)&sp;检测限随荧光计结构与流速而变,但对于大多数叶绿素与它们的降解产物来说,每次进样检测限范围在10～100pg.&sp;HPLC&sp;法的精确度主要取决于色素标准样的纯度.&sp;更理想的方法是测定标准样的吸收光谱(350～750nm)&sp;并与文献数据相比较.&sp;色素的纯度也可用HPLC&sp;法来测定,条件是不存在能与标准物的吸收和荧光谱带相重叠的共洗脱污染物.&sp;如果分光光度法测得的数据经脱镁色素校正,HPLC&sp;的结

果表达为色素当量(例如:叶绿素a&sp;当量=&sp;脱植基叶绿素a&sp;+&sp;叶绿素a&sp;+&sp;叶绿素a′,假定使用正确的分子量校正值)&sp;,那么HPLC&sp;法与分光光度法提供的色素浓度与提供的EPA&sp;标准符合得很好.&sp;因此如果明显的存在色素衍生物,用分光光度法测得的数据会偏高.&sp;要HPLC&sp;法与荧光法测得的数据一致则取决于附加的叶绿素b&sp;,c&sp;和它们的衍生物.

6&sp;　HPLC&sp;测定藻类叶绿素及类胡萝卜素

611&sp;　仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1)&sp;高效液相色谱泵,可进行三种不同溶剂的梯度输出,流速为110mlPm.

(2)&sp;装有200&sp;微升进样环管的高压进样阀.

(3)&sp;保护柱.&sp;(50&sp;3&sp;416mm&sp;,C18&sp;,5μm)

(4)&sp;封尾的反相色谱柱(250&sp;3&sp;416mm&sp;,5μm&sp;,C18&sp;)&sp;.

(5)&sp;可变波长或过滤吸光度检测器,带有低体积流通池,检测波长为436nm.

(6)&sp;数据纪录装置.

(7)&sp;注射器,玻璃,500μL

(8)&sp;HPLC&sp;洗脱剂:洗脱剂A(80∶20&sp;;&sp;甲醇∶015M乙酸铵,pH&sp;712)&sp;,洗脱剂B(90∶10&sp;;乙腈∶水)&sp;,洗脱剂C(乙酸乙酯)&sp;.

(9)&sp;校准标准物:叶绿素a&sp;和b&sp;,β,β2胡萝卜素可购买.&sp;其他色素标准物可用TLC&sp;或制备级HPLC&sp;从植物提取物种纯化得到.&sp;在校准HPLC&sp;系统前,在专用溶剂中使用装有单色器的分光光度计测定所有标准物的浓度.&sp;使用公式:

Ci&sp;=&sp;1000&sp;(Aλmax-&sp;A750nm)PE1cmb

式中　Ci&sp;=&sp;各色素的浓度mgPl

A&sp;=&sp;特定波长下的吸光度

E&sp;=&sp;吸光系数lPgcm

b&sp;=&sp;比色池长度cm

612&sp;　测定程序

(1)&sp;用洗脱剂A&sp;,流速为110&sp;mlPm&sp;,建立和平衡HPLC&sp;系统;

(2)&sp;通过先前制备的标准物校准HPLC&sp;系统的工作标准.&sp;混合1ml&sp;标准物与300μL&sp;蒸馏水,摇动,平衡5&sp;分钟后进样.&sp;用300μL&sp;标准液漂洗注射器2&sp;次,注射器中吸入500μL&sp;标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满200μL&sp;的进样环管.&sp;混合1ml&sp;90&sp;%丙酮与300μL&sp;蒸馏水作为空白液.&sp;建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高)&sp;的标准曲线.

(3)&sp;混合1ml90&sp;%丙酮色素提取物与300μL&sp;蒸馏水,作为进样样品.

(4)&sp;样品进样采用梯度程序用以优化叶绿素及类胡萝卜素的分离.

(5)&sp;通过比较样品峰与纯标准物峰的保留时间来定性.

(6)&sp;浓度的计算方法同512.&sp;(5)

(7)&sp;这种方法为叶绿素与类胡萝卜素的分离而设计,同时也可以分离主要的叶绿素分解产物.&sp;方法的精确度由测定三倍进样的浮游植物群落和植物的提取物确定.&sp;使用合适的内标物可提高精确度.

检测流程

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