藻类叶绿素及其降解产物的测定方法

发布时间:2022-03-28

下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法. 分别详细介绍了各种方法的设备,程序,计算公式及特点.。此外,还介绍了藻类类胡萝卜素的高效液相色谱测定方法。 按测定方法分为六个部分:(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ; (2) 叶绿素a 的荧光检测法; (3) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定; (4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; (5) 高效液相色谱(HPLC) 测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素。

藻类的特异性色素是叶绿素、叶黄素和胡萝卜素. 浮游藻类里常见的三种叶绿素是叶绿素a ,b 和c.叶绿素a 在一切浮游藻类里大约占有机物干重的1~2 % ,是估计藻类生物量的好指标. 细胞的叶绿素含量随种类或类群而有所不同,同时还受年龄、生长率、光和营养条件的影响.脱镁叶绿素a (一种叶绿素a 的普通降解产物) 能够干扰叶绿素a 的测定,因为如果存在脱镁叶绿素a ,它能在叶绿素a 的相同光谱区吸收光和荧光,造成叶绿素a 值的误差. 当测定叶绿素a 的时候还要测定脱镁叶绿素a. 叶绿素a 和脱镁叶绿素a 之比可作为浮游植物生理条件的一个良好指标.下文综述了用分光光度法,荧光检测法及高效液相色谱法测定藻类叶绿素及其降解产物的方法:

(1) 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法) ;

(2) 叶绿素a 的荧光检测法; 

(3) 存在脱镁叶绿素a时,叶绿素a 的分光光度法测定; 

(4) 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定; 

(5) 高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物; (6) HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素.

1 叶绿素a , b 和c 的分光光度法测定(三色法)

用丙酮水溶液自浮游生物浓缩样萃取色素,用分光光度计测定萃取物的吸光度. 叶绿素自细胞内提出的难度,不同藻类差异相当大. 为了将色素完全萃出,通常需要用组织研磨器机械的破坏细胞.

111  仪器和试剂

(1) 分光光度计:用窄带的(015~210nm) .

(2) 1cm ,4cm 和10cm 光程的比色池.

(3) 医用离心机.

(4) 组织研磨器(好使用圆底的研磨管和捣杆) .

(5) 离心管:15ml ,有刻度和螺帽.

(6) 过滤设备:过滤器,滤膜(0145μm 孔径,47mm 直径) 或玻璃纤维过滤器(GFPC 或GFPA ,415cm 直径) ,真空泵.

(7)MgCO3 悬浮液:在100ml 蒸馏水中加入110g 细粉末MgCO3 .

(8) 90 %(体积比) 丙酮水溶液.

112  测定程序

(1) 离心或过滤浓缩水样. 在离心前或过滤的后一步加入012ml MgCO3 悬浮液.

(2) 把样品置入组织研磨器,用2~3ml 90 %丙酮水溶液覆盖浸泡.

(3) 把样品移入一个有螺帽的离心管,用几毫升90 %丙酮水溶液洗研磨器,并把洗液加入到萃取液

中,用90 %丙酮水溶液调节体积到5~10ml .

(4) 在盖紧的离心管中于500g 离心20min 澄清萃取液,把澄清的萃取液倾入一支清洁的,标定过的15ml 有螺帽的离心管并测定萃取液的总体积.

(5) 把萃取液移入1cm 的比色池,在750、663、645 和630nm 测定吸光度(OD) .

113  计算

叶绿素a ,b 和c 的测定分别使用663、645 和630nm 的吸光度. 750 nm 的读数用来校正浑浊度. 将每个色素的OD 值中减去这个浑浊度校正值后,带入下列公式计算浓度:

(1) 叶绿素a (mgPl) = 11164 (OD663 ) – 2116 (OD645 ) + 0110 (OD630 )

叶绿素b (mgPl) = 20197 (OD645 ) – 3194 (OD663 ) – 3166 (OD630 )

叶绿素c (mgPl ) = 54122 (OD630 ) – 14118 (OD645 ) – 5153 (OD663 )

(2) 各单位体积色素量的计算如下:

叶绿素a (mgPm3 ) = 叶绿素a (mgPl ) ×萃取液的总体积(l) / 水样体积(m3 )

2 叶绿素a 的荧光检测法

叶绿素a 的荧光检测法比分光光度法灵敏,需样品较少. 而且不要求像分光光度法那样的波长分辨率,在430nm 的激发波长和在663nm 的发射波长抽取在试管内测定叶绿素a 可过的佳灵感度.

211  仪器和试剂

(1) 荧光计,备有高强度F4 T. 5 蓝光灯,光电倍增管R – 136 (红敏) ,可滑动窗孔,光发射(CS – 2 – 64)

和光激发(CS – 5 – 60) 滤光片,以及一个高灵敏度门.

(2) 其他设备和试剂同111

212  测定程序

(1)  用已知浓度的叶绿素溶液标定荧光计:

用分光光度法测定浓度约为2、6、20 和60μgPl 的叶绿素a 萃取液,再在每一灵敏度位置对每一溶液进行读数,导出标定系数Fs

Fs = CaPRs

式中 Fs ———灵敏度位置S 的标定系数

Rs ———灵敏度位置S 的荧光计读数

Ca ———分光光度法测定的叶绿素a 浓度(μgPl)

(2)  在能够取得适中读数的各灵敏度位置测定样品的荧光,将读数乘以适当的标定系数,得到叶绿素a 浓度..

3  存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的分光光度法测定

由于脱镁叶绿素在接近叶绿素a 相同的波长上有吸收,因而含有脱镁叶绿素时叶绿素a 的测定值可能偏高. 叶绿素a 由于酸化作用变成脱镁叶绿素a ,吸收峰的值比原来大约降低40 % ,并从663nm 移至665nm ,酸化前后产生的吸收峰之比为1170 ,可用来表观叶绿素a 的浓度作脱镁叶绿素a 的校正.

311  仪器和试剂

(1) 同111

(2) HCl 1mol·L – 1

312  测定程序

(1) 用90 %丙酮水溶液萃取色素,离心澄清,在750、663nm 读取OD 值.

(2) 在1cm 的比色池中用两滴1mol·L – 1 HCl 酸化萃取液,轻轻搅拌1~2min 后在750、665nm 读取OD 值.

(3) 酸化前OD663和酸化后OD665值都减去OD750值.

313  计算

使用校正过的值计算叶绿素a 浓度(C) 与脱镁叶绿素a 浓度(P)

C(mgPm3 ) = 26173 (663b – 665a)V1PV2L

P(mgPm3 ) = 26173[117 (665a) – 663b ]V1PV2L

式中V1 ———萃取液的体积(l)

V2 ———水样的体积(m3 )

L ———比色皿液层厚度(cm)

663b ,665a 分别为酸化前后90 %丙酮水溶液萃取的吸光度.

26173 是吸光度校正

4 存在脱镁叶绿素a 时叶绿素a 的荧光法测定

用荧光法测定脱镁叶绿素a 的浓度,需要测定酸化前后丙酮萃取液的荧光. 叶绿素a 由于酸化后变成脱镁叶绿素a ,致使荧光降低,利用这一原理进行测定萃取液的脱镁叶绿素a 浓度.

411  仪器和试剂

(1) 同21a

(2) HCl 1mol·L – 1

(3) 纯叶绿素a

412  测定程序

校准荧光计,在每一灵敏度位置测定酸化前后萃取液的荧光. 计算校准系数(Fs ) ,用酸化前的荧光读数除以酸化后的荧光读数,算出酸化前后的荧光比.

413  计算

叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (Rb – Ra) rP(r – 1)

脱镁叶绿素a (mgPm3 ) = Fs (rRa – Rb) rP(r – 1)

式中 Fs ———灵敏度位置S 的换算系数

Rb ———萃取液酸化前的荧光

Ra ———萃取液酸化后的荧光

r ———RbPRa
 

5  高效液相色谱测定藻类的叶绿素及它们的降解产物

511  仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱仪,流速为210mlPm.

(2) 装有100 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱(410 3 015cm , C18 , 3μm)

(4) 反相HPLC 柱(C18 , 10cm , 3μm)

(5) 荧光检测器,波长为430 ±30nm ,可发射超过600nm 荧光.

(6) 数据纪录装置,长条纸记录器或电子积分仪.

(7) 注射器,玻璃,250μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(80∶15∶5 ;甲醇∶Ⅰ型试剂∶离子对溶液) ,洗脱剂B(80∶20 ;甲醇∶丙酮) .

(9) 校准标准物:分别将1ml 纯叶绿素a 和b 溶于100ml 90 %丙酮中,用分光光度法测定其准确浓度. 用上述叶绿素a 和b 标准物经盐酸酸化后制得脱镁叶绿素a + a′和b + b′标准物;从硅藻中萃取叶绿素c 和脱植基叶绿素a ,酸化脱植基叶绿素a 制得脱镁叶绿素酸a ,分别用薄层色谱法(TLC) 纯化,分光光度法校准,作为标准物.

512  测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为210mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;校准荧光计的感光度,用叶绿素a 标样的浓度大值作为满刻度.

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准. 分别混合叶绿素与脱植基叶绿素a ,脱镁叶绿素a 和脱镁叶绿素酸a ,作为混合标准物. 混合1ml 标准液与300μL 离子对溶液,平衡5 分钟后进样. 混合1ml 90 %丙酮与300μL 离子对溶液作为空白液. 用150μL 标准液漂洗注射器2 次,注射器中吸入250μL 标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满100μL 的进样环管. 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高) 的标准曲线.

(3) 混合1ml 90 %丙酮色素提取物与300μL 离子对溶液,作为进样样品.

(4) 使用两步溶剂程序,用于优化叶绿素及其降解产物的分离. 进样后,5 分钟内将洗脱剂A 转变为洗脱剂B ,维持B15 分钟,流速为210mlPm. 在下一次进样前,需用洗脱剂A 重新平衡色谱柱5 分钟. 总分析时间约为25 分钟.

(5) 用下列公式计算各色素的浓度

Ci = AsFiVe

PVEVs

式中 Ci = 各色素的浓度mgPl

As = 各次进样的色素峰面积

Fi = 标准响应因子

Ve = 进样体积(011ml)

VE = 萃取体积(ml)

Vs = 样品体积(l)

(6) 这种方法仅用于叶绿素及其降解产物的定量.

(7) 检测限随荧光计结构与流速而变,但对于大多数叶绿素与它们的降解产物来说,每次进样检测限范围在10~100pg. HPLC 法的精确度主要取决于色素标准样的纯度. 更理想的方法是测定标准样的吸收光谱(350~750nm) 并与文献数据相比较. 色素的纯度也可用HPLC 法来测定,条件是不存在能与标准物的吸收和荧光谱带相重叠的共洗脱污染物. 如果分光光度法测得的数据经脱镁色素校正,HPLC 的结

果表达为色素当量(例如:叶绿素a 当量= 脱植基叶绿素a + 叶绿素a + 叶绿素a′,假定使用正确的分子量校正值) ,那么HPLC 法与分光光度法提供的色素浓度与提供的EPA 标准符合得很好. 因此如果明显的存在色素衍生物,用分光光度法测得的数据会偏高. 要HPLC 法与荧光法测得的数据一致则取决于附加的叶绿素b ,c 和它们的衍生物.

6  HPLC 测定藻类叶绿素及类胡萝卜素

611  仪器和试剂

除色素提取物外还包括:

(1) 高效液相色谱泵,可进行三种不同溶剂的梯度输出,流速为110mlPm.

(2) 装有200 微升进样环管的高压进样阀.

(3) 保护柱. (50 3 416mm ,C18 ,5μm)

(4) 封尾的反相色谱柱(250 3 416mm ,5μm ,C18 ) .

(5) 可变波长或过滤吸光度检测器,带有低体积流通池,检测波长为436nm.

(6) 数据纪录装置.

(7) 注射器,玻璃,500μL

(8) HPLC 洗脱剂:洗脱剂A(80∶20 ; 甲醇∶015M乙酸铵,pH 712) ,洗脱剂B(90∶10 ;乙腈∶水) ,洗脱剂C(乙酸乙酯) .

(9) 校准标准物:叶绿素a 和b ,β,β2胡萝卜素可购买. 其他色素标准物可用TLC 或制备级HPLC 从植物提取物种纯化得到. 在校准HPLC 系统前,在专用溶剂中使用装有单色器的分光光度计测定所有标准物的浓度. 使用公式:

Ci = 1000 (Aλmax- A750nm)PE1cmb

式中 Ci = 各色素的浓度mgPl

A = 特定波长下的吸光度

E = 吸光系数lPgcm

b = 比色池长度cm

612  测定程序

(1) 用洗脱剂A ,流速为110 mlPm ,建立和平衡HPLC 系统;

(2) 通过先前制备的标准物校准HPLC 系统的工作标准. 混合1ml 标准物与300μL 蒸馏水,摇动,平衡5 分钟后进样. 用300μL 标准液漂洗注射器2 次,注射器中吸入500μL 标准液用于进样,将注射器插入进样阀,充满200μL 的进样环管. 混合1ml 90 %丙酮与300μL 蒸馏水作为空白液. 建立标准色素浓度与荧光峰面积(或高) 的标准曲线.

(3) 混合1ml90 %丙酮色素提取物与300μL 蒸馏水,作为进样样品.

(4) 样品进样采用梯度程序用以优化叶绿素及类胡萝卜素的分离.

(5) 通过比较样品峰与纯标准物峰的保留时间来定性.

(6) 浓度的计算方法同512. (5)

(7) 这种方法为叶绿素与类胡萝卜素的分离而设计,同时也可以分离主要的叶绿素分解产物. 方法的精确度由测定三倍进样的浮游植物群落和植物的提取物确定. 使用合适的内标物可提高精确度.

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